Comunicazione presentata al convegno su "Colture in vitro e micropropagazione

in ortoflorofrutticoltura". Cesena, 2 giugno, 1989.

La micropropagazione del papavero d'Islanda

LIVIA MARTINÉTTI,

Istituto di Agronomia, Università di Milano

INTRODUZIONE

II papavero d'Islanda (Papaver nudicaule L.) è stato recentemente fatto oggetto di ricerche coordinate a livello nazionale volte ad approfondirne genetica, biologia, agrotecnica, fruibilità dei fiori allo stato reciso, malattie, poiché sono state ravvisate in esso elevate potenzialità di diffusione nella nostra Floricoltura, a motivo della sua rusticità, delle sue basse esigenze energetiche, del momento favorevole in cui si verifica la produzione (nel periodo invernale), del pregevole valore ornamentale dei suoi fiori leggiadri. Se ne è voluta indagare anche l'attitudine alla coltura in vitro, non tanto con l'obiettivo di rendere eventualmente questa tecnica sofisticata modo usuale di propagazione delle specie, che dovrebbe mantenere le sue prerogative di coltura a basso input energetico ed economico, quanto piuttosto per servire meglio al miglioramento genetico della specie. Infatti, la micropropagazione potrebbe consentire la rapida stabilizzazióne e moltiplicazione di genotipi pregevoli, quali gli ibridi F, che i fitomiglioratori stanno cercando di costituire.
Inoltre, essa risulterebbe molto utile qualora si volesse moltiplicare individui sterili per anomala morfologia floreale, quale è il caso di fiori con numerosi stami petaloidei; la petoloidia, d'altronde, è proprio caratteristica selezionata dai costruttori di cultivar di papavero d'Islanda.                                 

Allo scopo di evidenziare se anche tale specie, come già moltissime altre, si presta alla coltura in vitro, è stata impostata, a partire dal 1985, Un'ampia sperimentazione, ancora in corso. Resoconti dell'attività svolta sono in parte già stati pubblicati; in questa sede s'intende dare aggiornamenti riguardo al lavoro in atto, oltre a fare il punto sull'intera problematica.

MATERIALI E METODI

S'è provato a porre in coltura espianti diversi. Foglie, picciuoli, scapi fiorali e radici hanno dato risultati complessivamente deludenti. Infatti, i suddetti espianti si sono dimostrati molto sensibili a tutti i tipi di sterilizzazione provati (etanolo 70% per 2'; NaOCl, 0,5% di doro attivo per 2', 5' e 10'; NaOCl 0,25% per 5'; NaOCl 0,125% per 10'), venendone gravemente danneggiati senza possibilità di ulteriore sviluppo. Risultati migliori sono stati conseguiti ponendo in coltura gemme ascellari, semi, plantule allo stadio di cotiledoni espansi, ipocotili. Come substrato di base è stato impiegato quello di Murashige e Skoog, che in prove orientative condotte precedentemente era risultato migliore di quelli di Knop e di White; il pH è stato aggiustato a 5,6-5,8. Non è emersa l'utilità di variare il pH o d'incrementare il tenore in saccarosio (da 30 a 50 g.I).

Sono state eseguite numerose prove di sterilizzazione. Per le gemme ascellari sono state provate le seguenti: Na Od 1% di doro attivo per 10' e 15'; NaOCl 1,5% per 10'; NaOCl 2% per 5', 10' e 15'; NaOCl 2,5% per 10' (con gemma protetta da più foglie); età-nolo 70% per 1-2 sec. + NaOCl 1% per 10'; etanolo 70% per 1-2 sec. + NaOCl 1,5% per 10'; Ca(OCI)₂12% per 10'; HgCI₂ 0,5% per 5'; captano 0,12% per 5'. Per i semi, la steri­lizzazione è stata effettuata con NaOCl alle seguenti concentrazioni di doro attivo e dura­te: 0,9% per 15'; 1,2% per 15'; 2% per, rispettivamente, 5', 10' e 15'.

Prelevando espianti da piantine cresciute in vitro, s'è-avuto il vantaggio di poter evi­tare la loro sterilizzazione. Si sono posti in coltura le plantule allo stadio cotiledonare e gli ipocotili derivati in seguito alla semina in vitro.

Il substrato di base è stato opportunamente modificato nel corso della sperimentazio­ne. Le gemme ascellari sono state poste sui seguenti substrati: substrato di base; substrato di base + IAA alle concentrazioni, rispettivamente, di 1 mg/1,0,75 mg/1,0,5 mg/1; substrato di base + IBA concentrazioni di 1 mg/1, 0,75 mg/1, 0,5 mg/1; substrato di base + BAP 1 mg/1 e 0,5 mg/1 rispettivamente. Al momento del trasferimento s'è operato inizialmente asportando tutte le lamine fogliari, per stimolare l'accestimento. In seguito, a causa dello stato di sofferenza osservato sulle piantine così trattate, s'è proceduto eliminando soltanto le foglie più esterne di ogni cespetto, spesso imbrunite. I trasferimenti si sono resi neces­sari generalmente ogni 15-20 giorni. Ogni volta possibile, le piantine sono state clonale per divisione dei cespi.

Per le plantule allo stadio cotiledonare è stato impiegato il substrato di base arricchito o meno di BAP, IAA o IBA (0,5 o 1 mg/1). Gli ipocotili, lunghi circa 1 cm, sono stati posti su substrati contenenti 2,4 D (0,05 mg/1; 0,5 mg/1; 1 mg/1; 2 mg/1), che s'è dimostrato molto efficace nel promuovere la formazione di callo; nelle fasi successive, per ottenere la rigenerazione, i calli sono stati trasferiti su substrati con IAA, IBA e BAP a diverse concentrazioni (1 mg/1 e 0,5 mg/1).

Tutti gli espianti sono posti in camera climatizzata, a 20°± 2°C, 12 o 16 ore di luce (non è risultata differenza al riguardo), intensità di circa 2500 lux. I semi sono stati posti a germinare anche al buio.

Infine, sono state avviate prove di ambientamento in serra delle piantine micropropagate mediamente alte circa 4 cm e tutte presentanti apparato radicale più o meno sviluppato. Esse sono state poste in substrato composto da torba e sabbia, sotto nebulizzazione ed individualmente protette o meno da un vasetto di vetro capovolto.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Per quanto riguarda la sterilizzazione delle gemme ascellari, NaOCl non è stato, in generale, fitotossico, ma la sua azione sterilizzante è stata modesta (circa 34% d'inquina­mento alla concentrazione 2% per 15'). Buoni risultati sono stati invece ottenuti con Ca(OCl)₂12% per 10' (circa 6% d'inquinamento). Il cloruro mercurio è stato tossico per i tessuti, così come l'etanolo. Relativamente ai semi, l'inquinamento è stato contenuto entro valori soddisfacenti (mediamente 3,5%) e la germinazione è risultata complessivamente buona (83,9%), senza differenze dovute ai trattamenti di sterilizzazione.

I substrati impiegati hanno influito in vario modo sul ritmo di crescita delle gemme e sulla morfologia delle foglie derivate. La BAP ha spesso provocato la formazione di foglie deformate, bollose, a lamina molto espansa, con ampi angoli d'inserzione. Su substrato contenente IAA (la cui concentoazione ottimale è risultata essere 1 mg/1) si sono formate, invece, piantine con foglie assurgenti, di colore verde inteso e con lamine relativamente strette. Aspetti simili si sono osservati in presenza di IBA. In assenza di ormoni le piantine hanno manifestato crescita più lenta e portamento meno eretto rispetto a quelle che ne hanno fruito. Il tasso di moltiplicazione è stato mediamente 1:2 su substrato di base senza ormoni; 1:3 su substrato di base + IAA 1 mg/1, 1:2 su substrato di base + BAP 1 mg/1.

Relativamente alla coltura di plantule allo stadio cotiledonare, si può affermare che, in generale, la crescita è risultata più lenta di quella delle piantine provenienti da gemme ascellari; nel primo caso, inoltre, le foglie sono apparse più sottili, piccole e strette. La clonazione è avvenuta con tasso 1:2. Con questo tipo d'espianto l'inquinamento è stato irrilevante, per lo più di tipo batterico; molto frequente, invece, è risultata la comparsa di imbrunimenti, la cui causa rimane sconosciuta. Per quanto concerne gli ipocotili, la formazione di callo è stata maggiormente promossa da 2,4 D 0;5 mg/1. In generale, la formazione di callo è stata piuttosto lenta; essa è stata osservata anche dopo qualche mese dalla messa in coltura. La frequenza di episodi d'inquinamento è stata molto bassa. La rigenerazione è stata ottenuta con tutti e tre gli ormoni provati senza rilevanti differenze; i calli trasferiti in presenza di IBA, però, hanno rigenerato piante con più fitto capillizio radicale rispetto agli altri. Non sono stati rari i casi in cui si sono formati germogli con 2-16 foglie, con lunghezza variabile da 1 a 6-8 cm; di norma, ciascun callo ha differenziato più germogli, fino a 5-8. Il tasso di moltiplicazione avrebbe potuto essere molto elevato (fino a 1:10-1:12 per i calli più grossi; 1:2-1:3 per i più piccoli), ma per esigenze di spazio sono state eseguite meno clonazioni di quanto fosse possibile.

I semi germinati al buio hanno formato plantule con ipocotili molto lunghi. Ciò va considerato ai fini di successivi prelievi. Infatti, se si vorrà proseguire con la coltura in vitro di ipocotili, sarà consigliabile promuovere la germinazione al buio; viceversa, volendo porre in coltura le gemme, bisognerà far avvenire la germinazione alla luce.

Per quanto riguarda la prova d'ambientamento in serra, i risultati hanno finora porta­to ad una percentuale di successo di circa il 55% ponendo le piantine sotto mist, aumentata fino al 75% proteggendo individualmente le piantine con vasetti di vetro capovolti.

CONCLUSIONI

Dalla sperimentazione condotta è emersa la difficoltà a micropropagare Papaver, nudicaule L., che a stento si piega a tale tecnica. Le piantine cresciute in vitro hanno manifestato inizialmente una buona crescita; successivamente, però, dopo qualche mese di coltura, hanno presentato diffusi ingiallimenti e necrosi, difficilmente imputabili a carenze nutrizionali, perché presenti anche in seguito a trasferimenti molto frequenti e su substrati più fertili. Il tasso di moltiplicazione è stato complessivamente modesto (1:2), tranneche per i calli differenziati da ipocotile. In quest'ultimo caso i risultati sono stati ottimi: si è riusciti, infatti, a rigenerare intere piantine, la cui stabilità genetica è però ancora da valutare. Con la messa in coltura di gemme ascellari si sono originate piantine con ritmo di crescita maggiore rispetto a quelle derivate da gemma apicale, sebbene ancora molto minore di quello delle piantine allevate in vitro. Tra gli ormoni saggiati, IAA e IBA hanno stimolato lo sviluppo e la radicazione. La migliore modalità di sterilizzazione è stata con Ca(OCl)₂12% per 10.              

Ancora rimane da approfondire il complesso problema dell'ambientamento e della coltivazione in vivo delle piantine micropropagate. Finora abbiamo operato con piantine già radicate in vitro, ma forse, dati i fenomeni di deperimento che frequentemente si osservano dopo lunga permanenza in vitro, sarà opportuno valutare in futuro la possibilità di utilizzare per lo scopo piantine ancora senza radici, promuovendone la radicazione in vivo. Per quanto visto, infatti, appare consigliabile anticipare il prima possibile il momento dell'acclimatazione in serra.

Si ringraziano le D.sse B. Lazzari e M. Lombardi per la fattiva collaborazione.

BIBLIOGRAFIA

GHISLENI, P.L.; MARTINETTI, L. (1988): Sperimentazione sulla biologia e sull'aerotecnica del papavero d'islanda, pianta floreale alternativa. Annali Accademia di Agricoltura di Torino, voi. CXXX.

MARTINETTI, L. (1988): Valutazioni dell'attitudine del papavero d'islanda alla coltura in vitro. L'Informatore Agrario, n. 51.

MARTINETTI, L. (1989): La coltura in vitro del papavero d'islanda. Atti Giornata di studio su Papaver nudicaule L., Palermo 16 Maggio 1989.

"Autorizzazione alla divulgazione del presente lavoro, cortesemente concessa dalla Prof. Livia Martinetti."